Spektrofotometri
UV
Spektrofotometri
merupakan salah satu teknik analisa kualitatif dan kuantitatif yang dapat
diandalkan, peralatannya mudah, relatif sederhana, serta mudah pula cara
pengoperasiannya (Loung, 2006).
Spektrofotometri
bermula dari perkembangan ilmu spektroskopi yang mempelajari komponen-komponen
panjang gelombang dari sinar (radiasi) untuk menghasilkan spektrum. Kini
spektroskopi tidak hanya menyangkut radiasi sinar tampak tetapi juga jenis
radiasi elektromagnetik lain seperti sinar-X, ultra violet, inframerah,
gelombang pendek dan frekuensi radio (Loung, 2006).
1.1 Prinsip Dasar
Spektrofotometri adalah
metode analisis kimia yang didasarkan pada pengukuran seberapa banyak energi
radiasi yang diabsorbsi oleh suatu zat sebagai fungsi panjang gelombang (Loung,
2006).
1.2 Hukum Lambert-Beer
Pengukuran serapan
cahaya oleh larutan molekul diatur dengan hukum Lambert-Beer, yang ditulis
sebagai berikut :
Log
I0/It = A = εbc
Dengan
I0 adalah intensitas radiasi yang masuk, It adalah
intensitas radiasi yang diteruskan, A dikenal sebagai absorbans dan merupakan
ukuran jumlah cahaya yang diserap oleh sample, ε adalah tatapan yang dikenal
sebagai koefesien punahan molar dan merupakan absorbans larutan 1M analit
tersebut, b adalah panjang jalur sel dalam cm, dan c adalah konsentrasi analit
dalam mol per liter.
Dalam
produk farmasi, konsentrasi dan jumlah biasanya dinyatakan dalam gram atau
miligram dan bukan dalam mol sehingga untuk keperluan analisis produk ini,
hukum Lambert-Beer ditulis dalam bentuk berikut ini :
A
= a (1%, 1cm) bc
A adalah absorbans yang diukur, a
(1%, 1cm) adalah absorbans larutan 1% b/v (1g/100ml) dalam satu sel berukuran 1
cm, b adalah panjang jalur dalam cm (biasanya adalah 1 cm) dan c adalah
konsentrasi sample dalam g/100ml. Karena pengukuran dibuat dalam sel berukuran
1cm, persamaan tersebut dapat ditulis sebagai berikut :
Yang menghasilkan konsentrasi analit dalam g/100ml.
Monografi BP sering menyatakan suatu nilai baku a (1%, 1cm) untuk suatu obat,
yang akan digunakan dalam proses perhitungannya (Watson, 2009).
1.3 Instrumentasi
Spektrofotometer
merupakan alat yang digunakan untuk mengukur besarnya transmisi dan absorbansi
suatu zat uji sebagai fungsi dari panjang gelombang (Loung, 2006).
Menurut Loung (2006)
jenis spektrofotometer dibagi menjadi 2 jenis yaitu:
1.
Spektrofotometer berkas tunggal (single beam)
Hanya ada satu cahaya
tunggal dari monokromator yang melewati sample. Secara bergantian sel diisi
pelarut (blangko) kemudian berturut-turut diisi dengan larutan sampel dan
larutan standar untuk diukur serapannya.
2.
Spektrofotometer berkas ganda (double beam)
Pada tipe ini cahaya
monokromatis dibagi menjadi dua berkas dengan intensitas yang sama. Berkas yang
satu melewati sel berisi blangko sedangkan berkas yang lain melewati sel berisi
larutan sampel atau larutan standar. Kedua berkas kemudian disatukan dan
diterima oleh detektor.
Pada prinsipnya susunan
instrumen Spektrofotometer dapat digambarkan sebagai berikut (Loung, 2006) :
Instrumen Spektrofotometer UV-Vis
1.
Sumber cahaya
Untuk tujuan pengukuran
serapan molekul diperlukan sumber cahaya yang bersifat kontinyu yang energinya
konstan pada daerah panjang gelombang yang diinginkan. Lampu deuterium
menghasilkan spektrum kontinyu dalam daerah ultraviolet dan lampu tungsten
digunakan untuk daerah sinar tampak dan inframerah dekat.
2.
Monokromator
Alat ini berfungsi
untuk memisahkan radiasi cahaya putih yang polikromatis menjadi cahaya yang
monokromatis. Unsur penting dari monokromator ialah sistem celah (slit) dan sistem pendispersi.
-
Celah (slit)
Setiap monokromator
dilengkapi dengan celah masuk dan celah keluar. Kedua celah itu berperan untuk
menentukan sifat monokromatis radiasi yang dihasilkan dan sifat resolusi panjang
gelombangnya.
-
Sistem pendispersi
Terdapat tiga jenis
sistem pendispersi yaitu:
a.
Prisma, mendipersikan cahaya berdasarkan
indeks refraksi apabila seberkas sinar melewati antar muka dua medium yang
berbeda.
Prisma
pada Sistem Pendispersi
b.
Grating, bekerja atas dasar perbedaan
sudut pantul dari setiap cahaya yang mengenai kisi-kisinya.
Grating (Kisi) pada Sistem Pendispersi
c. Filter,
cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda dapat diperoleh dengan mengganti
filter sesuai ngjang gelombang yang diinginkan.
3.
Kompartemen sampel
Kompartemen sel adalah
wadah untuk larutan yang akan diukur serapannya dan dilengkapi tutup untuk
melindungi detektor dari cahaya dan menghindari kontak komponen optik dengan
bahan kimia.
4.
Detektor
Detektor berfungsi
mengubah sinar cahaya atau energi radiasi cahaya yang mengenainya menjadi suatu
besaran atau suatu yang dapat diukur, misalnya sinyal elektronik.
Menurut Loung (2006)
secara garis besar ada tiga jenis detektor yang sering dipakai :
-
Detektor Foto Sel
Digunakan untuk pengukuran radiasi
dalam daerah cahaya tampak. Terdiri dari dari plat elektroda yang dilapisi
bahan semi konduktor yang bagian luarnya disemprot lapisan tipis emas, perak
atau timah yang berfungsi sebagai elektroda pengumpul.
-
Tabung Foton Hampa
Terdiri dari katoda yang berbentuk
silinder dan kawat anoda yang keduanya berada dalam tabung kaca yang
dihamparkan.
-
Tabung Pengganda Foton
Mempunyai komposisi seperti pada
tabung foton tetapi dilengkapi dengan dioda yang lebih positif dari pada katoda
sehingga elektron-elektron akan dipercepat.
1.4 Analisis
Spektrofotometer dapat
digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif berdasarkan serapan panjang
gelombang maksimum dan intensitas pada pelarut dan kondisi tertentu. Bagian
molekul yang menyerap radiasi ultra violet dan cahaya tampak adalah gugus
kromofor, contohnya gugus karboksilat, amina, nitroso dan sebagainya (Loung,
2006).
1.
Analisis Kualitatif
Identifikasi suatu
senyawa dilakukan dengan membandingkan spektrum serapan senyawa yang sedang
diidentifikasi dengan spektrum serapan. Spektrum serapan suatu senyawa
merupakan karakteristik dari sifat absorbsinya terhadap radiasi elektromagnetik
dan berkaitan dengan struktur molekul senyawa tersebut (Loung, 2006).
2.
Analisis Kuantitatif
Pada analisis
kuantitatif dengan spektrofotometer, pengukuran serapan diusahakan pada panjang
gelombang maksimum agar diperoleh hasil analisis yang tepat dan teliti. Karena
perubahan serapan untuk setiap satuan konsentrasi paling besar pada panjang
gelombang maksimum, sehingga dapat diperoleh kepekaan analisis yang maksimal.
Selain itu disekitar panjang gelombang maksimum bentuk kurva serapannya datar
sehingga dapat memenuhi hukum Lambert-Beer dan dapat diperoleh ketentuan
pengukuran yang baik.
Menurut Loung (2006)
ada dua cara pelaksanaan analisis kuantitatif yaitu:
a. One Point Method
Dengan membandingkan
serapan larutan uji dengan serapan larutan standar yang sudah dibuat dan
diketahui konsentrasinya.
b. Multi Point Method
Menggunakan kurva baku
yang dibuat dari sistem dimana sebagai absis adalah konsentrasi larutan standar
dan sebagai ordinat adalah serapannya. Persamaan regresinya adalah :
y = bx + a
yang menunjukan hubungan linier
antara konsentrasi larutan standar dengan serapannya. Serapan larutan uji yang
diperoleh dari hasil pengukuran diplotkan pada kurva kalibrasi ini.
DAFTAR PUSTAKA
Loung,
F.S. 2006. Dasar-Dasar Spektrofotometri.
Laboraturium Balai Besar POM Bandar Lampung.